Muestra cortisol
Ensayo
Como biomarcador clásico de estrés se realizaron determinaciones de fracción libre de cortisol salival por electroquimioluminiscencia (ECLEIA), con reactivo Cortisol G2 Elecsys cobas e100 del laboratorio Roche. Cabe destacar que el cortisol salival se correlaciona altamente con el cortisol libre en sangre, dado que por su bajo peso molecular y liposolubilidad ingresa por difusión simple en la membrana basolateral de los acinos de las glándulas salivares (Poll et al., 2007).
Esta medición supone varias ventajas importantes. En primer lugar, constituye una estimación de la hormona libre, es una forma sencilla y no intrusiva de recolectar la muestra, no requiere ningún paso de extracción ya que las proteínas de unión al cortisol (globulina de unión a los corticosteroides y albúmina) no alcanzan la saliva, así como tampoco lo hacen los metabolitos del cortisol. Para su medición se empleará un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia de tipo competitivo (Elecsys Cortisol II Roche®), en el auto analizador multiparamétrico Cobas 6000 de Roche®. En este ensayo, el cortisol presente en la muestra es liberado de sus proteínas de transporte por la acción del danazol, y compite con el cortisol exógeno del test, que ha sido marcado con un complejo de rutenio, por el anticuerpo biotinilado. La mezcla de reacción se traslada a la célula de medida donde una corriente eléctrica desencadena la reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide en un fotomultiplicador. La cantidad de luz emitida será inversamente proporcional a la concentración de cortisol presente en la muestra, la cual se determina mediante una curva de calibración generada para el instrumento. El ensayo tiene una duración de 18 minutos y presenta un rango de medición de 0.054 ug/dL -63.4 ug/dL. El límite de cuantificación reportado por el fabricante es de 0.109 ug/dL, lo cual lo hace adecuado para su empleo en muestras de saliva, en las cuales la concentración de cortisol es muy baja. Asimismo, presenta reactividad cruzada con los corticoides habitualmente empleados en la práctica clínica, condición que debe considerarse en la elección de los participantes. El rango de referencia, reportado por el fabricante, para cortisol en saliva obtenido entre las 6 y las 10 de la mañana es: < 0.736 ug/dL (percentil 95) /< 0.874 ug/dL (percentil 97.5).
Protocolo de recolección de muestras:
Los adolescentes participantes recibieron instrucciones, tanto en forma escrita como oral, para la recolección de la muestra, junto con el contenedor. Complementariamente, las instrucciones fueron grabadas en un video tutorial de video que será trabajado previamente con técnicos y educadores de las contrapartes. Las muestras deberán recogerse en el domicilio de los adolescentes, entre las 7:00 y las 9:00 AM, en los días estipulados para tal fin, y hacerlos llegar ese mismo día a la sede de la contraparte (Gurises Unidos; Escuela de Oficios Don Bosco; La Huella y CECAP) donde serán preservadas en frío (heladera común). Aproximadamente 60 minutos antes de la toma de la muestra, el participante deberá evitar: comer, fumar, beber (excepto agua) o lavarse los dientes; también deberá evitar hacer actividad física en las 3 horas previas. Las muestras contaminadas con sangre serán rechazadas.
Para la obtención de la muestra, los participantes recibieron un frasco estéril de boca ancha, dentro del cual deberán salivar, sin succionar las encías. Se recolectó un mínimo de 3 mL de saliva y rotular las muestras con sus datos filiatorios, así como fecha y hora de obtención de esta. Las muestras se mantendrán refrigeradas hasta su llegada al laboratorio del Hospital de Clínicas. Una vez recibidas se trasvasan a un tubo de hemólisis y se centrifugarán 2 minutos a 1000 g según recomendación del fabricante. El sobrenadante así obtenido se separará y almacenará frizado hasta su procesamiento. Una vez finalizada la determinación requerida, la muestra salival será desechada y ningún material biológico será preservado. Cabe señalar que el proceso de recolección, transporte, embalaje y etiquetado, preservación y disposición final de las muestras biológicas está regulado por las normas nacionales establecidas en el Decreto Nº 382/014, y será realizado siguiendo las normas éticas de consentimiento informado para la creación y uso de biobancos y bases de datos en salud (Sánchez et al., 2017).